الرئيسية
أحدث الصور
من طرف الدرس العملي السادس : صبغ البكتيريا
THE STAINING OF BACTERIA
يمكن إجراء الفحص المورفولوجي morphology لخلايا البكتيريا بطريقتين :
1- بفحص الخلايا الحية دون صبغها ، كما يحدث في فحص حركةmotility البكتيريا.
2- بفحص الخلايا الميتة المصبوغةstained بالصبغات.
والبكتيريا الحية عديمة اللون تقريباً ، وتباينها مع الوسط المائي المعلقة به لا يكفي لرؤيتها بوضوح، لذلك فإن صبغ البكتيريا يجعلها تتباين contrast في اللون عن الوسط الموجودة به ، فتصبح مرئية visible ويسهل تمييزها . كما تستعمل أيضاً بعض الصبغاتdyes لتمييز التركيبات الداخلية للخلايا internal structures والتي بدون صبغها تكون غير مرئيةinvisible وبالإضافة إلى ذلك ، فإنه لكي تستخدم العدسة الزيتية oil immerging lens في الفحص للوصول إلى أكبر درجة تكبير ، فإنه من الأنسب استعمال تحضيرات مصبوغة stained preparations عن استعمال التحضيرات المبتلةpreparations wet mounts . رغم أن البكتيريا لا تبدو مختلفة بدرجة كبيرة عن الوسط المحيط بها ، إلا أنها تختلف عنه كثيراً من الناحية الكيميائية ، هذه الاختلافات الكيميائية بين البكتيريا والوسط ، هي التي تمكننا من تمييز البكتيريا بواسطة الصبغ . فالصبغة تتحد غالباً مع الخلية البكتيرية وليس مع الوسط المحيط.
وعلى ذلك فإن المزايا الرئيسية للصبغ هي :
1- توفير التباينcontrast بين الكائنات الدقيقة micro-organisms وبين الخلفية الموجودة فيها Background ، مما يسمح بالتمييز بين الأنواع المورفولوجية المختلفة morphology.
2- تسهيل دراسة التركيبات الداخلية internal structures للخلايا البكتيرية ، مثل : جدار الخلية cell wall، والأجسام النوويةnuclear bodies ،والجراثيم spores في الأنواع المتجرثمة.
3- تمكين البكتريولوجي من استعمال قوة تكبير أعلى higher magnification power.
وتستخدم الأنواع المختلفة من الصبغات dyes المتاحة الآن للعاملين في مجال البكتريولوجي , بطرق متعددة للصبغ الأساسي basic staining :
1-الصبغ البسيط simple stain
( أ ) صبغات قاعدية basic dye ( ب ) صبغات حامضيةacidic dyes
( ج ) صبغات غير محددة التأثير indifferent dye
2- الصبغ المركب ( التفريقي ) compound ( differential ) stain
مثل
( أ ) صبغة جرام Gram stain
3- صبغ تراكيب الخلية structural stain ( ب ) صبغة الجراثيم الداخلية endospore stain
وقبل إجراء عملية الصبغ ، يجب أن نثبتfix المادة التي سنفحصها، بمعنى أن تلتصق المادة بسطح الشريحة التي سنصبغ عليها. وإذا لم يثبت التحضير ، فإن غشاء Film الخلايا سيزول من على الشريحة أثناء عملية الصبغ.
تحضير وتثبيت الغشاء البكتيري للصبغ
Preparation and Fixation of Bacteria for Staining
Preparation and Fixation of Bacteria for Staining
أهمية التثبيت :
- يؤكد التصاق adhesion الخلايا البكتيرية على الشريحة الميكروسكوبية .
- يقتل الخلايا المثبتة .
- يغير طبيعة أنزيمات الخلية وذلك يمنعها من هضم أجزاء الخلية الذي قد يؤدي إلى التحلل الذاتي autolysis وفقد العينة .
طرق التثبيت :
أ- تثبيت بالحرارة heat fix:
ويتم إما بتمرير الشريحة على لهب بنزن Bunsen burner عدة مرات _ ويراعى أن استعمال الحرارة أكثر من اللازم سيشوه شكل وتركيب الخلية المصبوغة ، لذا يجب أن تكون الشريحة دافئة وليست ساخنة _ أو بوضع الشريحة على مسخن الشرائح slide warmer ( hot plate ) عند 60ºم لمدة عشر دقائق .
ب- تثبيت كيميائي chemically fix:
بوضع كحول ميثيلي methyl alcohol 95% لمدة دقيقة ثم نميل الشريحة للتخلص من الكحول الفائض .
طريقة العمل PROCEDURE :
والطريقة العامة الموضحة في هذا التدريب ، تعتبر أساسية في معظم طرق الصبغ المستعملة للبكتيريا . ففي هذا التدريب سنستعمل الحرارة لقتل الخلايا وتثبيتها على الشريحة.
1- نمرر سطح شريحةslide نظيفة في لهب بنزن Bunsen عدة مرات للتعقيم الجزئي ولإزالة ما يكون عالقاً بها من حبيبات دهن، ثم نتركها على حاملها لتبرد.
2- أ* بواسطة الإبرة ذات العقدةinoculating loop ، نضع غمستينtow loop full أو ثلاث من المزرعة السائلة على سطح الشريحة
ب* وفي حالة المزرعة الصلبة ، نضع نقطة ماء نظيفة في وسط الشريحة . ثم نأخذ جزءاً صغيراً من النمو البكتيري بواسطة الإبرة ذات العقدة inoculating loop ونمزجهما جيداً .
3- ننشر بالإبرة مزيج المزرعة الصلبة ( أو غمسه المزرعة السائلة ) على مساحة حوالي 1سم بوسط الشريحة ، لتكون غشاء رقيق thin film منتظم.
4- نترك الغشاء ليجف تماما في الهواء air dry على درجة حرارة الغرفة. أو بمسك الشريحة أعلى اللهب بحوالي 20cm بحيث لا يغلي الغشاء الموجود على الشريحة.
5- بعد ذلك نثبت الغشاء المتكّون بتمرير الشريحة في اللهب عدة مرات ( نراعي أن يكون سطح الشريحة الذي عليه الغشاء متجها باستمرار إلى أعلى ) .
*ملاحظات
- لتنظيف أي شريحة نستخدم المواد المنظفة أو الكاشطة مثل الصابون abrasive soap ثم نغسل ونجفف الشريحة . أو يمكننا أن نضع قطرة من الزّيلين xylene ( xylol )على سطح الشريحة ثم ننظف بقطعة قماش.
- إذا كانت الشريحة نظيفة فانه يمكن فرد المعلق على سطحها بانتظام ، أما الشريحة غير النظيفة فإن المعلق يتجمع على سطحها بشكل قطرات متفرقة ولا يتكون غشاء منتظم .
- تمسك الشريحة بالأصابع من حوافها حتى لا يعلق بها أي مواد دهنية موجودة بالأصابع .
والتثبيت النموذجي هو الذي يحفظ تركيبات الخلية في شكلها ووضعها الطبيعي ، دون حدوث تشوهات ، أو ظهور تركيبات لم تكن موجودة بالخلية الحية .
وبعد تثبيت الغشاء نقوم بعملية الصبغ stain، ونبدأ بالصبغ البسيط .
1- الصبغ البسيط simple stain :
يقصد به استعمال صبغة مفردة في صبغ الخلايا.
- ويعتمد الصبغ البسيط على حقيقة أن خلايا البكتيريا تختلف كيميائياً عن الوسط المحيط بها ، لذلك فإنها تصبغ لإظهار التباين بينها وبين الوسط.
- ويفيد في توضيح الفروق الموجودة في حجم الخلايا cell size، وشكلها morphology ، ونظام تجمعها arrangement.
* الصبغ البسيط الذي يستهدف الخلايا البكتيرية ذاتها يسمى الصبغ المباشر direct stain
* الصبغ البسيط الذي يصبغ الخلفية ويترك الخلايا البكتيرية غير مصبوغة
يسمى الصبغ السالب negative stain
الصبغ بالصبغات القاعدية Staining With Basic Dyes :
قد تستعمل لصبغ البكتيريا الصبغات القاعدية مثل : صبغات أزرق الميثيلين Methylene blue ، أوالكريستال البنفسجي Crystal violet ، أو كربول الفوكسين Carbol fuchsin ، أو السفرانين Safranin ، ورغم أن كل هذه الصبغات قاعدية إلا أنها تختلف عن بعضها في مدى درجة صبغها للخلية . فأزرق الميثلين والسفرانين أكثر بطأ في تفاعلهما مع الخلية السالبة الشحنة ، حيث يحتاج كل منهما 30-60 ثانية لصبغ الغشاء الميكروبي ، بينما الكريستال البنفسجي أكثر فاعلية ونشاطاً ، ويحتاج عادة لحوالي 10 ثوان .
فالشحنة السائدة على خلية البكتيريا هي نتيجة لتأثير حموضة الوسط الموجودة فيه . لذلك فإن خفض حموضة الوسط ( أي زيادة الرقم الأيدروجيني ) ، يزيد من مقدار الشحنة السالبة على الخلية مسبباً قوة جذب أكبر للصبغات القاعدية ، والعكس صحيح بالنسبة للصبغات الحامضية ، لذلك فإن الصبغ بالصبغات القاعدية يكون ضعيفاً عند رقم أيدروجيني منخفض ، بينما يكون الصبغ ضعيفاً بالصبغات الحامضية عند رقم أيدروجيني مرتفع.
طريقة العمل PROCEDURE :
1- نضع الشريحة التي عليها الغشاء المثبت – الذي سبق تحضيره في بداية هذا التمرين – على سلك للصبغ بأسفله حوض.
2- نغمر الغشاء بالصبغة المطلوبة ، ونتركها وقتاً كافياً للتفاعل : 30 ثانية لأزرق الميثيلين أو السفرانين ، و 10 ثوان للكريستال البنفسجي .
3- نتخلص من محلول الصبغة ثم نغسل الغشاء المصبوغ بالماء ، وذلك لإزالة الصبغة الزائدة.
4- نجفف الشريحة بوضعها بين ورقتي نشاف نظيف ثم تمرر أعلى اللهب عدة مرات.
5- نضع نقطة من زيت السيدر على الغشاء المصبوغ ثم نفحص بواسطة العدسة الزيتية high-power ( oil-immersion ) lens.
( إذا كان الغشاء المحضر سميكاً ، فسيظهر الغشاء المصبوغ ككتل متجمعة من مادة مصبوغة مع قليل جداً من الخلايا الفردية.)
طريقة فحص الغشاء باستعمال العدسة الزيتية :
1- توضع الشريحة على مسرح الميكروسكوب.
2- يضبط الضوء بالاستعانة بالعدسة الشيئية الصغرى والمكثف حتى يشاهد المجال الميكروسكوبي ومنطقة الغشاء مضاء إضاءة عالية ومتجانسة .
3- توضع نقطة زيت سيدرoil على الغشاء ثم تحرك القطعة الأنفية لوضع العدسة الزيتية في وضع الاستعمال ويدار الضابط الكبير حتى تنغمس العدسة في نقطة الزيت وتلامس سطح الشريحة ، يجب أن لا يدار الضابط بسرعة حتى لا تنكسر الشريحة . ونقوم بهذه الخطوة ونحن نراقب الشريحة والعدسة الزيتية من الخارج .
4- ننظر من خلال العدسة العينية ونحرك الضابط الدقيق لرفع أنبوبة الميكروسكوب إلى أعلى حتى نرى الخلايا البكتيرية بوضوح .
2- الصبغ المركب (التفريقي) compound(differential) stain
- الصبغ المركب :لأننا تستعمل في هذه الطرق أكثر من صبغة واحدة .
- الصبغ التفريقي : لأنه طريقة للتمييز، والتفرقة بين أنواع البكتيريا ،حيث تختلف الكائنات فيما بينها كيميائياً وفيزيائياً ، ولذلك فإنها تتفاعل بدرجات مختلفة بالنسبة لطريقة صبغ معينة ، وهذا هو الأساس الذي يعتمد عليه الصبغ التفريقي . وتعتبر صبغة جرام من أهم طرق الصبغ المركب المتبعة في الدراسات البكتيريولوجية .
