الرئيسية
أحدث الصور
من طرف الدرس العملي السابع : صبغة جـرام Gram Stain
باستعمال هذه الطريقة ، يمكن تقسيم البكتيريا إلى مجموعتين: موجبة لجرام gram-positive ، وسالبة لجرام gram-negative ، ويُعتقد أن سبب الاختلافات في الصبغ بين هذين النوعين من الخلايا ، يعود إلى الاختلافات الموجودة في طبيعة وتركيب الطبقات السطحية، أو جدر هذه الخلايا. عموماً .. فإن الخلايا الموجبة أو السالبة لجرام تميل إلى التفاعل بدرجات مختلفة مع كثير من العوامل الفيزيائية والكيميائية. وتحتاج صبغة جرام لأربعة محاليل مختلفة:
(أ) صبغة قاعدية Basic dye ( الصبغة الأساسية).
(ب) مرسخ Mordant وهو : عبارة عن مادة تزيد القابلية affinity ، أو الجذب attraction بين الخلية ، والصبغة ، بمعنى أنها تساعد على ترسيب الصبغة وتثبيتها على سطح الخلية بطريقة ما . من أمثلة المرسخات: الأحماض ، القواعد ، أملاح المعادن ، واليود. وباستعمال المادة المرسخة فإن الخلية تصبغ بقوة كما أنه يصعب إزالة الصبغة منها.
(ج) عامل مزيل للون Decolorizing agent وهو: عبارة عن مادة تزيل الصبغة من الخلية المصبوغة . بعض الخلايا المصبوغة تزول صبغتها بسهولة أكثر عن خلايا أخرى ، وفي صبغة جرام وبعض الصبغات التفريقية الأخرى ، فإن التفرقة بين أنواع البكتيريا تعود إلى الاختلافات في سرعة إزالة الصبغة بين تلك الأنواع.
(د) صبغة مضادة Counter stain (الصبغة الثانية) و هي : صبغة قاعدية تختلف في لونها عن لون الصبغة الأساسية المستعملة، والغرض من استعمالها إعطاء الخلايا التي أزيلت منها الصبغة الأساسية، لوناً يختلف عن لون الصبغة الأساسية. وعلى ذلك .. فإن الخلايا التي لم تزال منها الصبغة الأساسية تحتفظ بلون الصبغة الأساسية و تسمى خلايا موجبة لجرام ، أما الخلايا التي أزيلت منها الصبغة الأساسية فإنها تأخذ لون الصبغة المضادة وتسمى خلايا سالبة لجرام.
طريقة العمل PROCEDURE:
تستعمل مزارع حديثة العمر Young cultures عمرها 18-24 ساعة، لأن مثل هذه المزارع مازالت تحتفظ بخواص تراكيب جدار الخلية . أما المزارع القديمة المسنة old cultures فإنها تميل إلى فقد خاصية الصبغ الموجب لجرام.
1- نجهز أغشية من كل منBacillus cereus Escherichia coli; Micrococcus luteus . ونثبت الأغشية بالحرارة.
2- نصبغ الغشاء بمحلول الكريستال البنفسجي لمدة دقيقة.
3- نتخلص من محلول الصبغة ، ثم نغسل بالماء.
4- نغمر الغشاء بمحلول اليود Gram's iodine ونتركه لمدة دقيقة للتفاعل.
5- نتخلص من محلول اليود ، ثم نغسل بالماء .
6- نغسل بكحول الإيثانول 95% لإزالة اللون ، الغشاء الرقيق يكفيه من 10-20 ثانية. ويمكن أيضاً أن يضاف الكحول على الغشاء نقطة نقطة مع إمالة الشريحة للأمام والخلف حتى يصير الكحول المتساقط من الشريحة عديم اللون.
7- نغسل بالماء.
8- نصبغ بالصبغة المضادة وهي السفرانين لمدة 30 ثانية.
9- نتخلص من محلول الصبغة ، ثم نغسل بالماء .
10- نجفف الشريحة بورق النشاف ثم أعلى اللهب.
11- نضع نقطة من زيت السيدر على الغشاء ثم نفحص بالعدسة الزيتية .
خطوات الصبغ بصبغة جرام
جدول خطوات الصبغ بصبغة بجرام:
جدول خطوات الصبغ بصبغة بجرام:
خطوات الصبغ | الطريقة | النتيجة | |
جرام موجب | جرام سالب | ||
الصبغة الأساسية المرسخ إزالة لون الصبغة الصبغة المضادة | كريستال بنفسجي لمدة 30 ثانية محلول اليود لمدة 30 ثانية كحول 95% لمدة 10-20 ثانية صفرانين لمدة 20-30 ثانية | لون بنفسجي يستمر اللون بنفجسي يستمر اللون بنفسجي يستمر اللون بنفسجي | لون بنفسجي يستمر اللون بنفسجي غير ملون لون وردي |
تفرق صبغة جرام البكتيريا إلى مجموعتين مختلفتين على أساس الفروق الموجودة في طبيعة جدارها الخلوي . فبينما نجد أن الجدار الموجب لجرام في أغلب البكتيريا يتكون أساساً من طبقة سميكة من الببتيدوجلوكان Peptidoglycan نجد أن الجدار السالب لجرام يتركب من عدة طبقات Multilayered ، عبارة عن : طبقة رقيقة من الببتيدوجلوكان محاطة بطبقات خارجية من البروتين ، والليبيدات ، وعديدة السكريات ، والاختلاف بين نوعي البكتيريا في درجة نفاذية هذه التركيبات السطحية للمحاليل المستعملة في صبغة جرام ، يسب التفرقة في الصبغ.
3- صبغ تراكيب الخلية structural stain :
تستعمل طرق صبغ خاصة وذلك لتوفير التباين المطلوب ، لرؤية التركيبات المختلفة بخلية البكتيريا بواسطة الميكروسكوب الضوئي. وندرس هنا صبغة الجراثيم كمثال على الصبغات المستعملة في فحص تركيبات الخلية.
الدرس العملي الثامن :
صبغة الجراثيم الداخلية Endospore Stain
تكون أنواع البكتيريا التابعة لجنس Bacillus وجنس Clostridium تركيباً خاصاً يسمى بالجرثومة الداخلية Endospore وهي، على عكس الخلية الخضرية التي تكونها ، عبارة عن جسم شديد المقاومة ، لها القدرة على البقاء حية لمدة طويلة حتى تحت ظروف غير مناسبة من الحرارة المرتفعة والكيميائيات السامة. والجرثومة الداخلية تقاوم عملية الصبغ ، ولكن بمجرد أن تصبغ فإنها تقاوم بشدة عملية إزالة الصبغة منها ، أو الصبغ بالصبغة المضادة. ومن أشهر الطرق الستعملة لصبغ الجراثيم الداخلية طريقة شيفر وفلتون Schaeffer and Fulton . وفي هذه الطريقة تستعمل صبغة أخضر المالاكيت Malachit green مع استخدام التسخين - وبالتي لا تزول بالغسيل من الجروثومة - وذلك كصبغة أساسية ، وتستعمل صبغة السفرانيين كصبغة مضادة . وعلى ذلك فإن الجرثومة تُصبغ باللون الأخضر بينما تصبغ باقي الخلية (أو الخلية التي بدون جرثومة) باللون الأحمر الخفيف.
طريقة العمل PROCEDURE :
1- نحضر غشاء من مزرعة Bacillus cereus.
2- نغمر الغشاء بأخضر المالاكيت (5% محلول مائي) .
3- نسخن الشريحة أعلى اللهب إلى أن يبدأ البخار في التصاعد ، ونستمر لمدة 5 دقائق ، يجب أن لاتغلى الصبغة ولاتجف .
4- نصب الصبغة الزائدة بالحوض ثم نغسل الغشاء بالماء برفق.
5- نصبغ الغشاء بمحلول السفرانين لمدة 30 ثانية.
6- نتخلص من محلول الصبغة ، ثم نغسل بالماء.
7- نجفف الشريحة بورق النشاف ثم أعلى اللهب.
8- نضع نقطة من زيت السيدر على الغشاء ثم نفحص بالعدسة الزيتية .
يمكن استخدام الميكروسكوب المتباين الأطوار الضوئي لفحص الجرثومة الداخلية بدون صبغ، حيث تظهر الجرثومة كجسم أبيض كثيف بالخلية .
خطوات صبغ الجرثومة الداخلية
حركة البكتيريا The Motility of Bacteria
حركة البكتيريا The Motility of Bacteria
تنقسم البكتيريا من حيث حركتها الى قسمين :
1- بكتيريا متحركة motile .
2- بكتيريا غير متحركة non-motile.
فالبكتيريا لها نوعين من الحركات :
أ- حركة حقيقية true (vital) movement ترجع الى وجود الفلاجيلات
( الأسواط ) flagella ويمكننا دراسة الحركة في البكتيريا بطريقتين :
1- الطريقة المباشرة : صبغ الفلاجيلات staining the flagella of bacteria
2- الطريقة غير المباشرة : باستعمال طريقة النقطة المعلقة Hanging drop preparation
ويمكن معرفة حركة البكتيريا بطريقة تلقيح البيئة الصلبة بالوخز بالميكروب المراد معرفة حركته في أنابيب الآجار العميق كما درسنا سابقا.
ب- حركة براونية Braownian movement ترجع الى تصادم البكتيريا بجزيئات وسط الانتشار .
طريقة النقطة المعلقة Hanging drop preparation
وفي هذه الطريقة نختبر البكتيريا الحية والنامية في البيئة السائلة ، و يجب تمييز هذه الحركة عن الحركة البراونية
الأدوات والمواد اللازمة :
1- مزرعة Bacillus cereus في بيئة المرق المغذي عمرها 24 ساعة.
2- مزرعة Saccharomyces sp النامية في بيئة مرق الجلوكوز المغذي عمرها 48 ساعة.
3- شرائح ذات تجويف slide.
4- غطاء شرائح slide cover.
5- فازلين Vaseline .
طريقة العمل PROCEDURE :
1- نأخذ نقطة من المزرعة باستعمال الإبرة ذات العقدة ونضعها في وسط غطاء الشريحة الذي سبق تنظيفه مع عدم نشرها.
2- نضع الشريحة المجوفة ( المقعرة) أمامنا ثم بواسطة قضيب زجاجي رفيع سبق غمسه في فازلين نضع أربع نقط منه حول تجويف الشريحة.
3- نرفع الشريحة ونقلبها على غطاء الشريحة slide cover (slip)باحتراس بحيث يكون التجويف مواجهاً للنقطة ثم نأخذ الشريحة الملصق بها الغطاء ونضعها بحيث يكون غطاء الشريحة إلى أعلى على مسرح الميكروسكوب ( يجب أن نلاحظ أن تكون النقطة في وسط التجويف دون أن تلمس قاع الفجوة).
4- نفحص طرف النقطة بواسطة العدسة الصغرى بحيث نرى حافتها في وسط المجال الميكروسكوبي ، و يمكن الاستعانة بالحجاب Diaphragm للتحكم في الضوء لإظهار الحافة.
5- نفحص بواسطة العدسة الشيئية الكبرى 40 × مع استعمال الضابط الدقيق حتى ترى حافة النقطة ونشاهد الميكروبات وحركتها الموجودة بجوار الحافة.
