الرئيسية
أحدث الصور
من طرف الدرس العملي الخامس :
طرق عزل المزارع النقية Pure Culture Techniques
تختلف المستعمرات النامية في الشكل, والحجم, والقوام, واللون باختلاف أنواع الكائنات الدقيقة, فان مظهر المستعمرة يعتبر دليلا قيما للتعرف على المزرعة وللتأكد من نقاوتها.
أولا: الأطباق المخطوطةStreak Plate :-
عند وضع المزارع الميكروبية على سطح الآجار ونشرها بواسطة الإبرة ذات عقدة (loop) , فان هذا يسمى تخطيط (Streaking) , ويسمى الطبق المعد بهذه الطريقة طبقا مخطوطا (Streak Plate) .
الهدف من الأطباق المخطوطة: هو الحصول من معلق البكتيريا المركز على مستعمرات منفصلة تماما, وعند التلقيح.. فان الخلايا الكثيرة المتزاحمة الموجودة في بداية التخطيط تكون مستعمرات قريبة من بعضها, ولكن باستمرار التخطيط نلاحظ إعداد اقل فاقل إلى أن تبقى مستعمرات منفصلة تماما ومتباعدة.
v يمكن عمل الأطباق المخطوطة بأكثر من طريقة, وهنا طريقتان مشروحتان, وكلتا الطريقتين تعطيان نتائج ممتازة إذا أجريتا بدقة, كما في الشكل التالي...
الطريقة الأولىZigzag or Snake shape :
تعقم إبرة التلقيح ذات عقدة باللهب ثم تبرد بلمس حافة الاجار, ثم تغمس الإبرة في المزرعة, يلي ذلك التخطيط على سطح الاجار مكونة خطا متصلا يشبه الثعبان, ثم يغطى الطبق بغطائه الممسوك باليد اليسرى.
<TABLE cellSpacing=0 cellPadding=0 width="100%"> <TR> <td style="BORDER-RIGHT: #ece9d8; BORDER-TOP: #ece9d8; BORDER-LEFT: #ece9d8; BORDER-BOTTOM: #ece9d8; BACKGROUND-COLOR: transparent"> </TD></TR></TABLE> طريقة الأطباق المخطوطة | <TABLE cellSpacing=0 cellPadding=0 width="100%"> <TR> <td style="BORDER-RIGHT: #ece9d8; BORDER-TOP: #ece9d8; BORDER-LEFT: #ece9d8; BORDER-BOTTOM: #ece9d8; BACKGROUND-COLOR: transparent"> </TD></TR></TABLE> الطريقة الأولىZigzag or Snake shape : |
الطريقة الثانية Crossing shape:
يبدأ بعمل عدة خطوط متوازية. ثم تعقم الإبرة باللهب, يلي ذلك عمل عدة خطوط عمودية على مجموعة الخطوط الأولى. تعقم الإبرة ثانية وتكرر العملية. وهكذا نحقق تخفيف المزرعة.
بعد التحضين سوف تظهر المستعمرات المعزولة على مسارات بعض الخطوط.
<TABLE cellSpacing=0 cellPadding=0 width="100%"> <TR> <td style="BORDER-RIGHT: #ece9d8; BORDER-TOP: #ece9d8; BORDER-LEFT: #ece9d8; BORDER-BOTTOM: #ece9d8; BACKGROUND-COLOR: transparent"> </TD></TR></TABLE> <TABLE cellSpacing=0 cellPadding=0 width="100%"> <TR> <td style="BORDER-RIGHT: #ece9d8; BORDER-TOP: #ece9d8; BORDER-LEFT: #ece9d8; BORDER-BOTTOM: #ece9d8; BACKGROUND-COLOR: transparent"> </TD></TR></TABLE> | |
<TABLE cellSpacing=0 cellPadding=0 width="100%"> <TR> <td style="BORDER-RIGHT: #ece9d8; BORDER-TOP: #ece9d8; BORDER-LEFT: #ece9d8; BORDER-BOTTOM: #ece9d8; BACKGROUND-COLOR: transparent"> </TD></TR></TABLE> الأطباق المخطوطة الطريقة الثانية | <TABLE cellSpacing=0 cellPadding=0 width="100%"> <TR> <td style="BORDER-RIGHT: #ece9d8; BORDER-TOP: #ece9d8; BORDER-LEFT: #ece9d8; BORDER-BOTTOM: #ece9d8; BACKGROUND-COLOR: transparent"> </TD></TR></TABLE> الطريقة الثانية Crossing shape |
v في التدريب التالي, سنقوم بعزل مزارع نقية من البكتيريا باستخدام طريقة الأطباق المخطوطة.
الأدوات المستخدمة:
أطباق تحتوى على بيئة الآجار المغذى, ابر تلقيح البكتيريا, لهب بنزن, قطن, مادة مطهرة.
طريقة العمل PROCEDURE :
1. تعقيم كيميائي : استخدمي القطن المبلل بالمادة المطهرة لمسح وتطهير مساحة مناسبة من الطاولة التي أمامك.
2. تعقيم فيزيائي: شغلي لهب بنزن .
3. ضعي الإبرة على اللهب بوضع راسي حتى درجة الاحمرار ثم برديها على بيئة معقمة.
4. اختاري من المزرعة البكتيرية الخليطة التي أمامك مستعمرة بكتيرية وخططي بعناية طبقين أحدهما باستعمال الطريقة الأولى والطبق الثاني باستعمال الطريقة الثانية.
5. تحضن الأطباق مقلوبة ( الغطاء إلى أسفل) على درجة حرارة 37مْ لمدة 24 ساعة.
الغرض من قلب الأطباق: هو تجنب تكاثف الماء على الغطاء من الداخل ثم سقوطه على المجاميع البكتيرية النامية, فيسبب انتشارها وتداخلها مما يصعب عملية الفصل.
- ملاحظة: راعى باستمرار ضرورة كتابة بطاقة على كل طبق بتري مدون عليها اسمك وبياناتك العملية التي أجريت وتاريخها.
ü بعد التحضين افحصي النمو المتكون على سطح الآجار, لاحظي الاختلافات الموجودة بين المستعمرات من حيث الشكل والحجم والمظهر.
ثانيا: الأطباق المصبوبةPour Plate :
توفر طريقة الأطباق المصبوبة طريقة ثانية للحصول على مزرعة نقية من مزرعة خليطه. وهى تختلف عن الأطباق المخطوطة في أن بيئة الاجار تلقح وهى مازالت في حالة سائلة (لكن مبردة عند درجة حرارة 45مْ).
إن إضافة مادة مصلبة لمزرعة سائلة تحتوى على خلايا بكتيرية, تجعل النمو الناتج من خلية واحدة يثبت في مكانه, ويكون ما يعرف بالمستعمرة الثابتة التي تكون كتلة مرئية, وعلى ذلك فانه إذا ثبتت الخلايا الأصلية في مكانها على مسافات متباعدة, فان كل خلية حية أو تجمع من الخلايا ينمو في حالة منفصلة متباعدة عن الأخرى.
يمكن فصل خليط من البكتيريا وإبعاد الخلايا عن بعضها بالتخفيف, وتثبيتها في مكانها بواسطة البيئة الصلبة, وتركها لتنمو وتكون مستعمرات تعزل بعد ذلك في أنابيب مستقلة.
وعلى ذلك فان المستعمرات تتكون في البيئة وليس على السطح فقط ويعتبر هذا ميزة في بعض الحالات, مثل دراسة تأثير مستعمرة Strepto cocci على كرات الدم الحمراء. بالإضافة إلى ذلك فان طريقة الأطباق المصبوبة المنفذة بإتقان تمكننا من الحصول على توزيع منتظم للمستعمرات ومن سهولة عمليات العزل.
عند صب خلايا المستعمرة الخليطة بالأطباق ستقابلنا صعوبة في الحصول على التركيز المناسب من خلايا البكتيريا بالأطباق المصبوبة فهل ستكون الأطباق شديدة الازدحام بالمستعمرات النامية؟ فتصبح تلك الأطباق عديمة الفائدة؟ أم ستكون هناك أطباق بدون مستعمرات نامية بها نهائيا؟
وليست هناك طريقة دقيقة للتنبؤ بعدد الخلايا الحية الموجودة في عينة ما, مثل: عينة اللبن, معلق التربة, مزرعة بكتيريا عمرها ساعة. لذلك فانه يجب أن تقومي باستمرار بعمل تخفيفات عديدة من العينة, وصب أطباق عديدة أيضا. وعليك أن تتوقعي انك ستحصلين فقط على طبق واحد أو اثنين بهما أعداد مناسبة من المستعمرات. وعموما فان ما ستكسبينه من خبرة في عينة معينة سيمكنك من تقليل عدد التخفيفات الزائدة عن الحاجة.
وطريقة التخفيف بالإبرة ذات العقدة (Loop dilution procedure) ستمكنك عادة من الحصول على أطباق ذات تخفيفات مناسبة, والأساس في هذه الطريقة هو عمل تخفيفات كمية بشكل تقريبي من العينة الأصلية وذلك في بيئة الاجار.
v في التدريب التالي, سنقوم بعزل مزارع نقية من البكتيريا باستخدام طريقة الأطباق المصبوبة.
الأدوات المستخدمة:
أنابيب من الاجار المغذى العميق, إبرة تلقيح البكتيريا, مزرعة بكتيرية خليطة, خلاط فورتكسVortex Mixer أطباق بتري معقمة.
طريقة العمل PROCEDURE :
1. اصهري ثلاثة أنابيب من الاجار المغذى العميق, ثم برديه إلى درجة حرارة 45مْ.
2. تحت شروط التعقيم, انقلي ما يعلق بعقدة غمسه من إبرة التلقيح (مرة واحدة) من المزرعة البكتيرية الخليطة إلى أنبوبة الاجار الأولى.
3. اخلطي اللقاح جيدا بالبيئة بالطرق على الأنبوبة بإصبع السبابة, أو بلفها بين الكفين عدة مرات, أو باستعمال خلاط فورتكس , علما بان نجاح هذه الطريقة يعتمد على المزج الجيد لخلايا البكتيريا بالبيئة وانتظام توزيعها بها.
4. من الأنبوبة الأولى انقلي 2 غمسه إبرة (مرتين) إلى أنبوبة الاجار الثانية. اخلطي جيدا.
5. من الأنبوبة الثانية، انقلي 3 غمسه إبرة (ثلاث مرات) إلى أنبوبة الاجار الثالثة واخلطي جيدا.
6. يجب مراعاة أن تتم هذه الخطوات بسرعة لتجنب تصلب الاجار وتعذر صبها بالطبق, وذلك بسبب انخفاض درجة الحرارة السريع من درجة 45مْ إلى درجة 43مْ. ويمكن تجنب ذلك باستعمال حمام مائي مضبوط على درجة 45مْ, وحفظ الأنابيب به حتى صبها.
7. صبى كل أنبوبة في طبق بتري مستقل, حركي الطبق بعد صبه برفق حركة دائرية منتظمة لنشر الاجار بالطبق وتوزيع الميكروبات به, اتركي الطبق لكي يجمد.
8. حضني الأطباق على درجة حرارة 37مْ لمدة 48 ساعة.
9. افحصي المستعمرات النامية على الأطباق المختلفة.
في الأطباق المزدحمة.. فان المستعمرات النامية تميل لان تكون صغيرة جدا ومتصلة يبعضها, لدرجة أن النمو يظهر في شكل سحابة معتمة نتيجة التوزيع العشوائي, وتكون منتشرة Spread out كبيرة وغالبا دائرية Circular . وعلى العكس من ذلك, فان المستعمرات النامية في عمق الآجار تكون صغيرة نسيا وعدسية الشكل Lenticular وهذا نتيجة الظروف المحددة للنمو في عمق الآجار.
في حالة المجاميع الخليطة من الكائنات الحية الدقيقة الموجودة بالمصادر الطبيعية مثل ( المحتويات المعوية, خضر متخمرة, تربة....الخ) يلاحظ أن بعض الأنواع توجد بأعداد كبيرة جدا عن أعداد أنواع أخرى. وهذا يمثل نقطة ضعف بالنسبة لطريقة التخفيف المستعملة لأغراض العزل. فالكائنات الموجودة بأعداد صغيرة ستخفف على الدرجة التي تناسب تخفيف أعداد الأنواع السائدة المزدحمة. لهذا.. فانه لعزل الأنواع السائدة. وهذا سيسمح بنمو الأنواع غير السائدة, وبذلك يصلح عزلها من التخفيفات البسيطة.
عزل مزرعة بكتيرية Isolation of Bacterial Culture :
بعد أن أعددت بنجاح الأطباق المخطوطة والمصبوبة, عليك الآن أن تنقلى خلايا من مستعمرات مختلفة، متباعدة تماما عن بعضها, إلى أنابيب بيئة البيون المعقمة.
بعد التحضين... فان هذه الخلايا المنقولة على البيئة تنمو مكونة مزارع نقية. بمعنى أنها خلايا لنوع واحد Single Species من الميكروبات.
يجب أن تختبري نقاوة هذه المزارع بالتخطيط على طبق بتري، فإذا كانت كل المستعمرات النامية على هذا الطبق لها نفس المظهر, فانه من المحتمل أن تكوني قد حصلت على مزرعة نقية.
