الرئيسية
أحدث الصور
من طرف Flow Cytometer
مقياس الجريان الخلوي
تعريف الجهاز flow cytometer
هو جهاز الكتروني يمرر الجزيئات الواحدة تلو الأخرى من خلال شعاع من الليزر و عبر جهاز حساس الذي يقيس الخواص الفيزيائية و الكيميائية لهذه الجزيئات و الخلايا .
هو تقنية تسمح لخلية وحيدة أن تقاس بناءً على اختلاف الخواص، و تحدد بفحص كيفية جريانها في السائل
تجمع المعلومات عن الخلايا بقياس إطلاق الضوء المرئي أو الفلورة، متيحة للخلايا أن تصنف على أساس خواصها الفيزيائية أو البيوكيميائية أو المستضدية .
المبدأ العام: تعرف المقايسة الخلوية بالجريان انها تسليط أشعة الليزر على مجموعة خلوية منعزلة حيث يمر الضوء عبر الخلايا ( تشتت أمامي FSC)أو ينعكس بعيدا عنها ( تشتت جانبي SSC )ويقاس كلا التشتتين بواسطة مكشافات ضوئية ، كما يتم كشف تألق المواد الواسمة المتألقة والتي يتم ضبطها بواسطة طول موجة الليزر
والضوء المستعمل هو ضوء الليزر حيث يمكن ان نستعمل ليزر وحيد اللون ذو ضوء أزرق للإثارة، الذي يمكن أن يسجل تفلوراً أخضر، برتقالي، وأحمر.
يرشح الضوء الصادر باستخدام مراشح ضوئية نوعية طول الموجة والتي تمرر أطوال موجة محددة وتعكس الأخرى
يتم تحويل الضوء المنعكس الى إشارة كهربائية بواسطة أنابيب مضخم ضوئي PMTS
تفرز المعطيات بواسطة برنامج حاسوبي خاص ويتم تخطيطها وبذلك يمكن فرز انماط مختلفة من الخلايا.
يستخدم الـ flow cytometrمبدأ تشتت الضوء ، و استثارة الضوء , و اصدار الجزيئات المفلورة لتوليد بيانات نوعية متعددة الثوابت من الجزيئات و الخلايا التي معدل قطرها من 0.5 إلى 40 ميكرون.
يتم تركيز الخلايا هيدروديناميكياً في غمد قبل اعتراضها لمصدر الضوء .
الليزر هو الأكثر استعمالاً كمصدر للضوء في الـ flow cytometr.
تحقن العينة في مركز غمد الجريان (Sheath flow ) . يقل قطر المجرى مجبراً الخلية على الدخول ضمن السيل (stream) . و بذلك تمر كل خلية على حدا إلى شعاع الليزر .
ماهي أهمية القياس الخلوي بالتدفق ؟
شملت تطبيقات القياس الخلوي بالتدفق، في العقدين الأخيرين، جميع فروع العلوم البيولوجية
إذ يمكن بهذه التقنية أن يقاس التبدل في خصائص الخلايا التي معدل قطرها من 0.5 إلى 40 ميكرون مثل:
التعبير النوعي للمستضدات السطحية.
النشاط الأنزيم داخل الخلايا.
درجة الحموضة PH.
تحديد حجم الخلية
تحديد درجة تحبب الخلية
قياس التبدل في خصائص الخلايا من خلال قياس محتواها من الـ DNA .
Apoptosis
دراسات جرثومية وفيروسية
تتحدد إمكانية هذه التقانة بـ: الملونات المتألقة المستعملة، وبخيال الباحث والذي غالبا ما يكون الأكثر أهمية.
كيف يتم كشف هذه الصفات :
إن جهاز الـ Flow Cytometer يستقصي كيفية تفاعل الخلية مع ضوء ليزري موجه عليها من خلال دراسة:
• كيفية نثر الخلية للضوء الذي يعطي فكرة عن حجم الخلية و عن مدى تعقيدها الداخلي ( التحبب )
1- حجم الخلية : عن طريق قياس الضوء المنتثر المستقيم (forward scatter FSC )
2- تحبب الخلية و مدى تعقيد محتواها الداخلي: عن طريق قياس الضوء المنتثر الجانبي (side scatter SSC (
• كيفية و مدى تألق الخلية :
بقياس كثافة تألقها بالفلورة: FL1, FL2, FL3, FL4
يتم هذا القياس أو الكشف أثناء مرور الخلايا (واحدة تلو الاخرى)في الجهاز الكاشف ضمن تيار من السائل وبعد وسم المستضدات الموجودة على سطح هذه الخلايا بأضداد وحيدة النسيلة مفلورة
تكمن مقدرة هذه التقنية في إمكانية قياس عدة معايير parameters في عشرات الآلاف من الخلايا المستقلة خلال عدة دقائق
تحديد وإحصاء جماعات خلوية فرعية بشكل دقيق.
فرزٍsorting الجماعات الفرعية فيزيائيا أو كهربائيا من أجل الدراسات اللاحقة
أنماط القياسات:
تتحرك خلية واحدة عبر مصدر الاستثارة , و الضوء المرتطم بالخلايا إما أن يتبعثر أو يمتص ثم يعاد اصدراه ( التألق ) .
هذا الضوء المبعثر أو المعاد اصداره يجمع بواسطة المتحري .
تشتت الضوء light scatter:
تبعثر الضوء هو نتيجة لاصطدام شعاع الضوء بالخلايا محدثاً إما انعكاس أو انكسار للضوء ثم يصل إلى المتحري . نموذج الضوء المبعثر يعتمد على حجم و تحبب الخلايا , معطياً قياس نسبي لهذه الخواص الخلوية عند تدفق الخلايا من خلال الشعاع .
التشتت الأمامي: forward scatter
يكون أكثر حساسية من التشتت الجانبي للخصائص السطحية للجزيئة , يستخدم للتمييز ما بين الخلايا الحية و الميتة.
التشتت الجانبي side scatter:
يكون أكثر حساسية للمكتنفات ضمن الخلية من التشتت الأمامي.
يستخدم للتمييز ما بين الخلية المحببة و الغير محببة.
الفلورة fluorescence:
ما هو الضوء المفلور:
يمتص الجزيء المفلور طاقة من الضوء المحرض (ضوء الإثارة )
ثم يحرر الطاقة الممتصة بآليتين :
-الاهتزاز و نشر الحرارة
-اصدار فوتونات بطول موجة أطول من موجة الضوء الذي تم توجيهه إليها و هذا ما يدعى بالفلورة ( ضوء الإصدار (
يستخدم الـ flow cytometr هذه التقنية عن طريق فلاتر لمنع الضوء الأصلي الصادر من الوصول إلى المتحري ، بينما يسمح لاصدار التألق بالمرور من أجل الكشف .
التألق و الأصبغة المفلورة Fluorescence And Fluorochromes
في تجارب الـ flow cytometr يحقق التألق غالباً عن طريق فرز مدروس للمكونات الخلوية بواسطة واسم متألق عادة ( نوع من الأصبغة) .
هذه الأصبغة تتألق فقط عندما يصطدم بها ضوء بطول موجة معينة ( خاصة بتواتر الليزر ) ، مسبباً اصدار ضوء ثانوي عند طول موجة مختلف . كشف طول الموجة الثاني يستخدم كقياس لوجود الصباغ على الخلايا و هكذا توسم ( تصنف) المكونات .
الأصبغة المتألقة الأكثر شيوعاً هي أحمر Texas , فلوريسين ايزو تيوسيانات (FITC) و فيكوايرترين (PE) .
إن اختيار الملون المفلور الذي سيستعمل يتأثر بالتطبيق و أطوال موجة الإثارة المتوفرة .
الجدول التالي لا يعني الشمولية ، لكن يندرج فيه الملونات المفلورة الرئيسية ، تتعلق أطوال موجات الإثارة و الانبعاث معاً بتطبيقاتها الشائعة . كل هذه الملونات المفلورة يمكن أن تستعمل في وسيلة FACS
أقسام الجهاز:
يتألف الـ flow cytometrمن الأقسام التالية:
مصدر الإثارة أو الضوء : نموذجياً ليزر يصدر ضوء عند طول موجة محددة.
مجرى سائل : الذي يحرك الخلايا المفصولة من خلال الجهاز و عبر الليزر .
مكونات بصرية : والهدف منها تركيز الضوء على المتحريات .
المتحريات : و هي على نوعين:
A- photo diode forward
B- photo multiplier tubes
والأول لتحري الضوء المتبعثر الأمامي و الحانبي
والثاني لقياس تألق الضوء
الحاسوب
آلية العمل:
يتحول الضوء المبعثر أو الصادرمن الخلايا و الجزيئات إلى نبضات الكترونية بواسطة متحريات بصرية . يلتقط الضوء بواسطة عدسات بؤرية موضوعة عند نقطة تقاطع الخلايا مع مصدر الضوء . يرسل الضوء إلى متحريات مختلقة باستعمال مراشح بصرية .
على سبيل المثال موجة بطول 525 نانومتر تمر عبر مرشح موضوع في مسار الضوء السابق للمتحري سامحاً فقط للضوء الأخضر بالمرور إلى المتحري .
النمط الأكثر شيوعاً للمتحري المستعمل في الـ flow cytometr هو PMT ( photomultiplier tube ) .
تكشف النبضات الكهربائية الناشئة عن الضوء بواسطة PMTs و من ثم تعالج من قبل سلسلة مضخمات خطية و لوغاريتمية , التضخيم اللوغاريتمي في أغلب الأحيان يستعمل لقياس تألق الخلايا . يوسع هذا النوع من التضخيم الإشارات الضعيفة و يزيد نوعية إشارة التألق.
بعد تضخيم الإشارات أو النبضات المختلفة فإنها تعالج بواسطة محول يدوي أو رقمي (ADC ) الذي بدوره يسمح للأحداث أن ترسم بيانياً ( رسم بياني نسيجي أحادي أو ثنائي المعالم ) .
تخزن بيانات الـ flow cytometrفي ملفات كمبيوتر .
Fluidics وحدة السوائل
السائل الحامل عبارة عن سائل ملحي معادل للتوتر يدعى سائل الغمد sheath
عينة الخلايا: عبارة عن معلق للخلايا بتركيز 5×510 إلى 2× 106 خلية/ مل
المبدأ:
يتم تدفق الخلايا في المعلق على شكل فردي خلال حجم محدد في حجرة خاصة , ويتحقق ذلك في معظم الأجهزة المصممة على مبدأ حقن العينة في سائل الغمد sheath fluid تحت الضغط حيث تمر العينة عبر فتحة صغيرة (20-300 µm ( وعندما تكون الشروط صحيحة لتوجيه الخلايا لنقطة الكشف بدقة +1 ميكرون أو أفضل.
يتدفق سائل العينة في اللب المركزي دون أن يمتزج بسائل الغمد بآلية (Hydrodynamic Focusing)
(ادخال حجم صغير ضمن حجم كبير بحيث يصبح متمركزا على طول المحور)
نظام الضغط الإيجابي Positive Pressure Systems
• يعتمد على الضغط التفاضلي بين العينة
• وسائل الغمد
• يتطلب ضغطا إيجابيا متوازنا بواسطة الهواء
• أو الأزوت
• يكون معدل التدفق متباينا بين 6-10 م/ثا
حجرة التدفق The flow cell: تتوضع حجرة التدفق flow cell ضمن الجهاز, الغرض منها تمرير و إرسال الخلايا إفراديا لنقطة معينة، والتي يتركز فيها منبع الضوء ويتم ذلك بحقن العينة في مركز جريان سائل يدعى سائل الغمد sheath fluid”“ ..
2- وحدة البصريات Optics:
وحدة التحريض (المنبع الضوئي ، العدسات ):
يتم بواسطة الضوء الليزري و العدسات التي توجه و تركز هذا الضوء
جمع الأشعة الصادرة:
يتم بواسطة مرايا و مراشح لتوجه الأشعة ذات طول موجة معينة إلى الكاشف المخصص لها.
وحدة التحريض: منابع الضوء Light sources
1- مصابيح القوس الكهربائية الزئبقية : تستعمل في بعض الأجهزة مصابيح الزئبق و الكزينون وهي مفيدة كمنبع رخيص للضوء فوق البنفسجي، لكنها لا تملك الحساسية الكافية لملاحظة التألق المناعي المنخفض لأنها تعطي مجالاً واسعاً من أطوال الموجات و لكن التوجيه و التحديد (focus) فيها محدود ويجب أن ينتقى طول الموجة الصحيح للإثارة باستعمال مرشحات ضوئية عند استخدام القوس الكهربائية .
2- الليزر LASER ( (Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation
- الضوء الناتج عن المصباح الليزري يكون وحيد اللون و وحيد الاتجاه
- أضواء الليزر المختلفة لها أطياف مختلفة و أطوال موجة مختلفة و الضوء الليزري الاكثر استخداماً هو ضوء شوارد الارغون حيث يعطي ضوءاً أزرق بطول موجة 488 نم.
كما يمكن استعمال ليزر إضافيred – diode laser يعطي ضوءاً أحمراً بطول موجة 635,يمكن ان يسجل تفلوراً برتقالياً
- تفضل المنابع الليزرية لأنها تعطي ضوء وحيد اللون ولديها حجم بؤري spot صغير، وهذا هام من أجل :
- الحصول على إثارة عظمى لخلية مفردة
- ضمان أن خلية واحدة فقط تمر في حزمة الليزر، وذلك في معظم الأوقات وعند معدل تدفق مقبول ( تقريباً 1000خلية /ثانية ).
تركيز (تبئير) حزمة الإثارةFocusing the excitation beam
تُسلط حزمة الضوء على مجرى العينة. ويتم ذلك بواسطة:
• عدسات بسيطة تعطي مقطعا عرضيا نموذجياً للحزمة، حوالي 30- 50 ميكرمتر.
• تستعمل بعض الأجهزة عدسات اسطوانية كروية لإنتاج حزمة إهليلجية بأبعاد 60x20
إذا مرت الخلية خلال الحزمة ببطء مبتعدة عن المحور، فإنها ستتلقى مستوى أخفض من الإضاءة وبالتالي فإنها ستعطي تألقا أقل. ويتضاءل هذا التأثير في حزمة ذات شكل إهليلجي والتي لها شكل جانبي منبسط، وهذه ميزة في تحليل الـ DNA حيث يسعى المستثمر للتخلص من أي تبدل بين الخلايا يحدثه الجهاز.
خواص الفلاتر: Filter Properties
فلاتر الموجة الطويلة Long pass filters تسمح بمرور أطوال موجات أعلى من موجات القطع cut-on
فلاتر الموجة القصيرة Short pass filters تسمح بمرور أطوال موجات أقل من موجات القطع cut-off
فلاتر التمرير العصابي Band pass filters تمرر أطوال الموجات في مجال range ضيق قريب من طول موجة محددة
تمرر (تُخرج) مرشحات التمرير العصابي band pass filters الحزمة الضوئية بشكل عصابة ضيقة وتستعمل عموماً مباشرة أمام الكاشف. وخصائصها الهامة هي طول الموجة القمي للإصدار، والنسبة المئوية للضوء الصادر عند طول الموجة القمي وعرض عصابتها
القنوات البصرية: Optical Channels
القناة البصريةoptical channel هي السبيل الذي يسلكه الضوء من نقطة الإضاءة إلى الكاشف .detector
تقوم المكونات البصرية بفصل separation الأقنية واختيار طول الموجة wavelength selection ليصبح لدينا عدة قنوات :
1- قناة التبعثر الأمامي forward scatter channel
2- قناة التبعثر الجانبي أو بالزاوية 90 درجة side or 90o scatter channel
3- قناة تفلور fluorescence channel منفردة لكل مادة مفلورة
1- قناة التبعثر الأمامي :
عندما يستخدم الليزر كمنبع ضوئي، فإن كمية الضوء المتبعثر scattered بالاتجاه الأمامي forward (على طول نفس المحور الذي يسير فيه ضوء الليزر) تكشف في قناة التبعثر الأمامي forward scatter channel.
2- قناة التبعثر الجانبي:
عندما يستخدم الليزر كمنبع ضوئي، فإن كمية الضوء المتبعثر scattered بالاتجاه الجانبي side (بزاوية عامودية على محور سير ضوء الليزر) تكشف في قناة التبعثر الجانبي أو بالزاوية 90 درجة side or 90o scatter channel.
3- قنوات التألق : Fluorescence Channels:
يكشف التألق الصادر عن كل ملون متفلور عادة في قناة تفلور fluorescence channel منفردة
ويتم كشف التألق بالتحكم بطول الموجة باختيار الفلاتر والمرايا.
3 - النظام الالكتروني Electronics:
الكشافات Detectors :
تتحول الإشارات الضوئية التي تصل إلى الكاشف إلى اشارات الكترونية ( نبضات كهربائية في الفولتاج تختلف شدتها بحسب شدة الإشارة الضوئية الواصلة إليها)
Photodiode -1 : يستخدم للإشارات القوية (على سبيل المثال كشف التبعثر الأمامي FSC )
Photomultiplier tube (PMT) -2 :
أكثر حساسية من النمط السابق.
ويمكن أن تتخرب بالتعرض للضوء الشديد. تستعمل من أجل قياس التفلور والتبعثر الجانبي SSC
يتم قياس ارتفاع هذه النبضات و من ثم تخضع لدراسة على الكمبيوتر
تدرس الإشارة الناتجة من حيث:
ارتفاعها Height : اعلى قيمة وصلت لها peak
عرضهاWidth : استمرارها
مساحتها: S=H*W
معالجة الإشارات من الكشافات:
1- التضخيم :Amplification
التضخيم الخطي: استخدامه محدود بشكل عام (تحديد المحتوى من DNA)
التضخيم اللوغاريتمي: التضخيم اللوغاريتمي في أغلب الأحيان يستعمل لقياس تألق الخلايا . يوسع هذا النوع من التضخيم الإشارات الضعيفة و يزيد نوعية إشارة التألق.
2- التحول الرقمي أو القياسي Analog/Digital conversation:
يتم تحديد القمة لكل موجة مقاسة ثم تحفظ و تحول إلى عدد رقمي يتم نقله إلى الحاسوب لتخزين و تقييم البيانات.
من أجل إجراء القياس المتزامن simultaneously لأكثر من تبعثر scatter أو تفلورfluorescence من كل خلية، يستخدم عادة أقنية متعددة multiple channels و كشافات متعددة multiple detectors
يجب أن يؤخذ بالاعتبار عند تصميم تناسق الأقنية المتعددة:
الخواص الطيفية spectral properties للملونات المتفلورة fluorochromes المستخدمة
الانتظام الصحيح proper order للفلاتر والمرايا.
الحصول على البيانات:
- كل قياس من كل كاشف يسمى parameter
- يتم الحصول على البيانات على شكل قائمة “list” من القيم لكل Parameter (متغير) لكل حادثة “event” (خلية).
إظهار و تفسير بيانات الـ flow cytometr:
- يقاس مقدار الضوء المبعثر أو المتألق بواسطة متحري و يحتاج بشكل لاحق إلى الاظهار من أجل التفسير . هذه الصور للخلايا تظهر بشكل طبيعي:
* التمثيل البياني النقطي dol plot
* التمثيل البياني الإحصائي Histogram .
1- الرسم البياني النقطي ::dot plot represntation
يستعمل معلمين للرسم البياني للبيانات الناتجة عن تحاليل الجريان , كل نقطة تمثل مرور خلية واحدة من خلال المتحري .
المحاور X , Y تقيس الاصدارات المختلفة مظهرة نقطة لكل من الخلايا التي تبدي نفس الاصدار الخاص .
الرسم البياني النقطي (dot plot represntation) التالي يبدي كثافتين من الخلايا تم تحليلها بواسطة الـ flow cytometr. كل خلية من نمط كثافة معين سوف تبدو بوضوح كنقطة في الربع من الرسم البياني النقطي المصمم لهذه الكثافة الخلوية.
2- الرسم البياني Histogram:
في هذه الرسوم البيانية المحور X يظهر كثافة الاشارة المكتشفة و المحور Y يقيس عدد الأحداث ( الخلايا) المحصاة .
يظهر Histogramغالباً نتاج عينتين أو أكثر باستعمال اشارة الفلورة
في تجارب تحديد وجود أو عدم وجود واسم خلوي معين أو زيادة أو نقصان نسبي في واسم بعد المعالجة التجريبية , فإن الرسم البياني النسيجي يظهر التغير في كثافة الفلورة لخلايا العينة .
هذا الرسم البياني النسيجي يظهر عدد الخلايا و كثافة الفلورة:
A و B إشارة إلى قمة كثافة الفلورة . التغير يظهر أنه يوجد زيادة نسبية في معدل فلورة الخلايا من أجل المعالجة B مقارنة مع المعالجة A .
تحليل النتائج Data Analysis:
* مثلا قياس معيار واحد يعطينا فكرة عن تقسيم العينة بناء على هذا المعيار( الضوء المنتثر المستقيم مثلا يقسم العينة على خلايا كبيرة و صغيرةً).
* قياس معيارين ( الضوء المنتثر المستقيم و الجانبي) يعطينا جدولاً بيانياً فيه كل محور تابع لأحد المعيارين.
* وبنفس الطريقة و باستخدام ثلاثة معايير يكشف لنا المعيار الثالث
( الفلورة ) ال subpopulation التي تكون ذات إشارة فلورة.
استخدام Flow Cytometer في Cell Sorting:
FACS
يمكن فصل الخلايا المطلوبة (ذات المعايير المطلوبة) عن العينة الأم بعد خضوعها للفحص ضمن الجهاز.
يتم هذا الفصل إما ميكانيكياً ((Mechanic sorting
أو كهربائي (electrostatic sorting).
فرز ميكانيكي : حيث يتم بوساطة الضغط على الخلايا المراد فرزها بعد ان يتم قياسها. مثلاً ضوء ليزري يفحص الخلايا عند كشف خلية على انها ” خضراء" يتم إرسالها إلى الأنبوب المخصص لجمعها:
* إما أن يوضع الانبوب في أسفل تيار التدفق
* أو بتطبيق ضغط على تيار التدفق يدفع بالخلية إلى أنبوب الجمع
فرز الكتروني : حيث تشحن خلايا بشحنة سالبة واخرى موجبة. بعد ذلك تمرر هذه الخلايا المشحونة ضمن حقل كهربائي في نهايته أنبوب الفصل و بذلك تتجه كل خلية بحسب شحنتها إلى الأنبوب المناسب لها.
الفرز الالكتروني الفرز الميكانيكي
100الف خلية/ثا 300خلية/ثا
فرز نوعين او اكثر فرز نوع واحد من الخلايا
آلية عمل FACS
يقترن الصباغ إلى ضد وحيد النسيلة و يرتبط إلى تلك الخلايا المغطاة بالمستضدات الذي يكون هو الضد النوعي لها .
يوجه معلق الخلايا إلى مجرى رفيع بحيث أن الخلايا تمر في رتل أحادي .
يوجه شعاع ليزري نحو المجرى عندما تمر كل خلية موسومة من خلال الشعاع ، فإن فلورتها الناتجة يتم كشفها بواسطة خلية كهرضوئية .
توجد في نهايته فوهة مهتزة بسرعة 40000 دورة في الثانية التي تقطع المجرى إلى 40000قطيرة منفصلة كل ثانية.
تكتسب كل خلية شحنة كهربائية موجبة أو سالبة
تحتفظ القطيرات بهذه الشحنة عندما تمر بين زوج من الصفائح المعدنية المشحونة .
القطيرات المشحونة إيجابياً تنجذب إلى الصفيحة المشحونة سلبياً و العكس بالعكس .
القطيرات غير المشحونة ( تلك التي لا تحوي على خلية أو تحوي على خلية لم تتفلور) تمر بشكل مباشر إلى وعاء ثالث و ترمى لاحقاً.
مراحل العمل:
1- تحضير العينة.
2- تحضير الصباغ.
3- تطبيق الصباغ.
4- تطبيق العينة ضمن جهاز cytometer.
تطبيق الصباغ:
Live staining
Fixed and permeabilised cells for intracelluler staining.
أنواع الصباغ:
DIRECT STAINING:
With Fluorochrome - Conjugated Antibodies
INDIRECT STAINING :
(With Fluorochrome - Unconjugated Primary Antibodies and Fluorochrome - Conjugated Secondary Antibodies)
التطبيقات السريرية لمقياس التدفق الخلوي
1- تحديد محتوى الـ DNA:
يتم تحديد محتوى الـ DNA الخلوي عن طريق وسمه بمادة مفلورة، ( الأكثر استخداماً هو يود البروبيديوم IP)، ثم القيام بتحليل التدفق، حيث تتناسب كثافة تألق أو سطوع الخلية مع كمية اﻠ DNA في الخلية (أعظم كمية من الـDNA، أعظم كثافة للتألق).
ولأن الخلايا تحتوي كميات مختلفة من الـDNA حسب مراحل دورة الخلية فإن كثافة التألق تعتمد على هذا المحتوى.
تتألف الدورة الخلوية من عدة أطوار :
G0: طور الراحة
G1: يكون فيه محتوى الخلايا الطبيعية من اﻟDNA مضاعف الصيغة الصبغية diploid (2N)
S: طور تركيب اﻟDNA : يزداد خلاله محتوى اﻠDNA حتى يتضاعف أي بين 2N و 4N
G2: (فترة التحضير للانقسام) حيث تكون الصيغة 4N
ثم تدخل الخلايا مرحلة الانقسام الفتيليmitosis الطورM وتنقسم لتعيد دورتها الخلوية.
يمكن بقياس محتوى اﻟ DNA أن نحدد فيما إذا كانت الخلايا في الطور G0/G1 أو الطورS أو الطورM/G2 من الدورة الخلوية.
عادة ً نجد أغلب الخلايا تكون في الطور G0/G1 من دورة الخلية و تملك محتوى DNA (2N)، وهو محتوى أغلب الخلايا الطبيعية في أجسامنا. ونجد 6% أو أقل من الخلايا تملك محتوى DNA (4N).(الصورة على اليمين)، حيث تظهر القمة (2N) كبيرة على مخطط التدفق، بينما القمة 4N تكون أصغر بكثير.
وأي تبدل في معايير الدورة الخلوية سينعكس عل شكل المخطط الترسيمي ﻠﻠ DNA،(الصورة على اليسار)، يعني أي اختلال صبغي كبير ( خلايا بمحتوى DNA شاذ ) يمكننا من رؤية قمة (2.8N) على يمين القمة (2N) كما في مرض Barrett's esophagus حيث تشكل مجموعة الخلايا ذات الخلل في صيغتها الصبغية 78% من الخلايا.
إذاً يسمح لنا تحليل اﻠ DNA بتحديد:
- نسبة الخلايا في الطور G0/G1، S، و M/G2 في الدورة الخلوية.
- محتوى اﻠ DNA غير الطبيعي في الخلية (اختلال الصيغة الصبغية)، ويكون دليل قوي على وجود الخباثة، ولكنه ليس واصم، فقد تترافق الأورام الحميدة مع اختلال في الصيغة الصبغية، وقد تكون الصيغة الصبغية طبيعية في العديد من الأورام الخبيثة.
عند غياب الاختلال المميز في الصيغة الصبغية يمكن أن نستخدم زيادة الفعالية التكاثرية (زيادة الطور S أو الطور S والطور M/G2) كواسم للخباثة.
2- تقييم واصمات سطح الخلية:
يستخدم مقياس التدفق الخلوي لتحديد أنماط الواصمات والمستقبلات على سطح الخلية، حيث يتم ربط الأضداد أو ربائط المستقبل بصباغ تألقي، ثم تقدم الخلايا إلى المقياس، ويتم تحديد كمية المستقبل على سطح الخلية حسب شدة التألق.
يمكن بهذه التقنية تحديد أكثر من واصم متألق واحد في نفس الوقت وذلك باستخدام صباغ تألقي خاص بكل مستقبل، وهذا يسمح للباحثين بتحديد مجموعات الخلايا الحاوية على مستقبلات متعددة.
مثال: تحديد الواصمات على الخلايا التائية:
تملك هذه الخلايا المناعية على سطحها بروتينات واصمة تعرف بالـ CD4 ، و CD8 .
توجد في الثدييات خلايا T إيجابية الـ CD4 و خلايا T إيجابية الـ CD8 و خلايا T إيجابية لكلا الواصمين .
لتحديد الوفرة النسبية للخلايا الحاملة للواصمات المختلفة، يتم حضن أضداد اﻠ CD4 المرتبطة إلى الـ FITC (fluorescein isothiocyanate) و أضداد اﻠ CD8 المرتبطة إلى أحمر Texas مع الخلايا T .
عند التحليل بالـ flow cytometr تتألق الخلايا إيجابية الـ CD4 بالأخضر بينما الخلايا إيجابية الـ CD8 تتألق بالأحمر و الخلايا إيجابية الـ CD4 و الـ CD8 تعطي ضوءاً أخضر و أحمر.
يعطي كشف مستويات كل لون متألق قياس لمقدار كل نوع من الخلايا T الموجودة في المزيج الخلوي .
التنميط المناعي Immunophenotyping
هو تقنية تستخدم لتحديد الجزيئات المرتبطة بالخلايا اللمفاوية و التي تساعد في تمييزها، وتكون قابلة للكشف لأنها تعبر عن نفسها بوجودها على سطح الغشاء الخارجي للخلية.
و تتم معرفة هذه الجزيئات باستخدام أضداد خاصة موسومة بأصبغة تألقية ترتبط معها بشكل نوعي، عندها تدعى هذه الجزيئات بالمستضدات، والجزء النوعي للجزيئة الذي يرتبط بالضد يدعى بالحاتمة epitope .
بعد ارتباط الأضداد الموسومة بالخلايا تتم معالجتها بعدة طرق:
التألق المناعي Immunofluorescence :
إذا كانت العينة عبارة عن مقطع نسيجي، يتم فحصه تحت مجهر التألق، وستلمع الخلايا المرتبطة بالأضداد في الظلام .
التدفق الخلوي flow cytometr :
عندما تكون العينة عبارة عن خلايا معلقة في سائل، فإن الخلايا يمكن أن تتدفق خلال مقياس التدفق الخلوي. وهذا سيكشف الخلايا في سيل من السائل واحدة تلو الأخرى بشعاع الليزر، فإذا وجدت أضداد مرتبطة بشكل صحيح، فإنها ستتألق والـ flow cytometrسيسجل الإشارة.
بهذه التقنية يمكن أن نميز بين الخلايا B , T لأن هذه الخلايا تنتج أنماطاً متميزة من الجزيئات السطحية، والأكثر من ذلك، يمكن أن نميَّز بين تحت الأنماط الفرعية للمفاويات بواسطة Cluster Designation (CD) .
3- عد الخلايا T و الخلايا B بواسطة الـ flow cytometr:
عولجت عينة من الدم البشري الطبيعي بواسطة ضد وحيد النسيلة موسوم نوعي للمستضد السطحي للخلايا T ( CD3) وضد وحيد النسيلة مرتبط إلى صباغ مفلور آخر ونوعي للمستضد السطحي للخلايا B المعروف بـ (CD19) .
كثافة التألق ترسم بيانياً على المحور X ، عدد الخلايا على المحور Y . لوحظ أن عدد الخلايا B هو بشكل أساسي أقل من عدد الخلايا T .
4- عد المجموعات الخلوية الفرعية في الدم البشري الطبيعي:
تكون الأضداد وحيدة النسيلة المفلورة موجهة ضد الجزيء CD4 والجزيء CD8.
تكون الخلايا T إيجابية الـ CD4 مسؤولة عن العديد من الاستجابات المناعية المتواسطة بالخلايا و تقدم المساعدة للخلايا B .
الخلايا T إيجابية الـ CD8 هي اللمفاويات T السامة للخلايا.
عند البشر الأصحاء نلاحظ تفوق الـ CD4 على الـ CD8 .
عند مرضى الـ AIDS تصبح هذه النسبة مقلوبة و المجموعة الفرعية إيجابية الـ CD4 يمكن أن تتلاشى في النهاية .
5- تحليل الكريات الحمر :
يمكن بواسطة مقياس التدفق الخلوي تحديد أنماط ومراحل نضج الكريات الحمر، وهذا يساعد في تشخيص العديد من الأمراض.
مثلاً، تستخدم أضداد CD55 و أضداد CD59 النوعية للعامل المعجل للبلى decay-accelerating factor والمثبط الغشائي للتحلل على التوالي من أجل التشخيص النهائي للبيلة الهيموغلوبينية الليلية الانتيابية Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) وهو اضطراب مكتسب في الخلية الجذعية النسيلة.
حيث يمكن تحديد عند المرضى مجموعتين أو أكثر من الكريات الحمر الحاوية على CD55 و CD59 بدرجات مختلفة .
(A) يوجد تعبير عالي عن CD55 و CD59في كل الكريات الحمر لدى الأشخاص الطبيعيين
(B) بينما نجد مجموعتين مميزتين عند مرضى اﻟ (PNH):
كريات حمر طبيعية مع تعبير عالي عن CD55 و CD59
مجموعة ثانية مع تعبير منخفض عن CD55 و CD59
مثال آخر: يعتمد تعداد الشبكيات على اﻠ RNA أو الريباسات المتبقية في الكريات الحمر غير المنواة غير الناضجة، حيث يتم عد الشبكيات بواسطة مقياس التدفق الخلوي باستخدام أصبغة تألقية ترتبط مع اﻠ RNA المتبقي مثل thiazole orange
تزودنا هذه الطريقة بالتمييز الممتاز بين الشبكيات والكريات الحمر الناضجة.
6- تحليل اختلاف الكريات البيضاء:
إن تطبيق الـ Fluroescence flow cytometr ( FFC) يعطي نتائج ممتازة يمكن الاعتماد عليها من أجل تحليل الاختلاف في كريات الدم البيضاء. بقياس كثافة الفلورة يمكن معرفة محتوى الحموض النووية في النوى بالإضافة إلى كامل الخلية، وبالتالي يعطي معلومات عن النشاط أو المقدرة على التكاثر لكل كرية دم بيضاء محيطية ملونة بشكل مستقل. وبذلك يمكن كشف العينات الشاذة بمصداقية عالية.
مجموعات الكريات البيض المختلفة و طلائع الخلايا غير الناضجة تظهر تفاعل نوعي مع الصباغ المفلور.
7- تحليل الصفيحات:
يعد قياس التدفق الخلوي طريقة ممتازة ومفيدة في تشخيص أمراض الصفيحات مثل مرض الفرفرية قليلة الصفيحات المناعية الذاتية autoimmune thrombocytopenic purpura، وفيه لا تشاهد الأضداد حرة في المصل بشكل متكرر مثل الأضداد المرتبطة بالصفيحات.
حيث يستخدم صباغ تألقي مثل thiazole orange الذي يرتبط باﻟ RNA، ويسمح بالتحديد الكمي للصفيحات غير الناضجة (وتسمى أيضاً الصفيحات الشبكية).
يفيد تعداد الصفيحات الشبكية في تحديد معدل تكون الصفيحات، وهذا القياس يمكن أن يصنف قلة الصفيحات غير المفسرة إلى:
- الناتجة عن زيادة تخرب الصفيحات
- الناتجة عن عيوب في انتاج الصفيحات
8- مراقبة المثبطين مناعياً:
في حالات اغتراس الأعضاء يتلقى المريض جرعات عالية من كابتات المناعة وكذلك في علاج أمراض المناعة الذاتية مثل الذئبة الحمامية الجهازية وبعض السرطانات مثل اللمفوما واللوكيميا.
إن من المهم لدى هؤلاء المرضى مراقبة الأخماج لديهم بشكل دقيق ومبكر، يتم ذلك من خلال تقنية قياس التدفق الخلوي لمراقبة أي ارتفاع ولو كان طفيفاً في الخلايا التائية .
من الممكن بهذه الطريقة دراسة الحالة المناعية من خلال التحديد الدقيق للخلايا التائية والبائية من خلال تحديد المستقبلات السطحية بمقياس التدفق الخلوي لها مثل:
1-CD2 موجود على سطح جميع اللمفاويات التائية والقاتلات الطبيعية
2- CD3 توجد على سطح جميع الخلايا التائية.
3- تحتوي الخلايا البائية : على سطحها CD22- CD20- CD19
