الرئيسية
أحدث الصور
من طرف [center]تقنية التهجين المناعي ( Immuno blotting Hybridization) لتحديد النوع الوراثي للفيروس الكبدي سي (HCV Genotype)
يجرى هذا التحليل لتحديد النوع الوراثي للفيروس الكبدي "سي " وتستخدم هذة التقنية طريقة التهجين العكسي) (Reverse Hyperdizationلمنطقة تدعى الـ (5-UTR) اختصارا (UN Translated Region) في جينوم الفيروس في عينة المصاب مع باديئات معلمة ومتخصصة للأنواع الوراثية المختلفة للفيروس(Specific Probe Genotype) الموجودة في أشرطة الكاشف التي تحتوي على تتابعات معينة من ( Oligonuclutide ) وهي الجزيئات الاولية المكونة للحمض النووي (RNA) , وكل خط في هذة الشرائط تنتظم فيه(Oligonuclutide) بتتابع معين ترمز لنمط جيني مختلف , سميت هذة الخطوة بالتهجين العكسي لاننا نمرر(Biotinylated DNA) الذي يرتبط بنوع من الفيتامين يدعى Biotin)) , وهذا الفيتامين لة قابلية الارتباط وبشدة مع بروتين يدعى (Avidin) يعلم به انزيم يستخدم في مرحلة الكشف عن حدوث تطابق مثالي بين (Oligonuclutide) المهجن للفيروس والتتابعات الموجودة في الشريط ويظهر على شكل راسب بنفسجي تسهل رؤيتة. حيث اننا نتحدث على مستوى جيني لا يمكن رؤية مكوناته بالعين المجردة وانما يحتاج لنظام كاشف خاص وقد استخدم في اجراء هذا الإختبار الكاشف HCV Genotype Assay(LiPA) من شركة Bayer Health Care ويختبر هذا الكاشف 20 عينه فقط .نوع العينات المستخدمة:
يستخدم لإجراء هذا الإختبار نواتج تكبير الحامض النووي للفيروس الكبدي "سي "(Amplicon ).
محتويات الكاشف:
1)منصة بلاستيكية تثبت عليها قنوات طولية مجوفة بطريقة تسمح لشرائط النيتروسليولوز بالإنغمار بها و كل منصه تحتوي على 8 قنوات كل قناة مخصصة لعينة واحدة فقط.
2)20 شريط نيتروسيليولوزي معلمة بتتابعات معينة من Oligonuclutide ) ) التي يرمزكل منها لنمط جيني مختلف من الفيروس ومحفوظة في أنبوبة بلاستيكية.
3)لاصقات شفافة مانعة للتسرب.
4)محلول الغسيل (Stringent Washing Solution) .
5)عبوة المتلازم الإنزيمي المركز( (Consantraed Conjugate.
6)عبوة محلول المتلازم الإنزيمي المخففDiluant) .(Conjugate
7)عبوة الـكاشف اللوني للرابط الإنزيمي المركز(Consantraed Substrate) .
عبوة محلولالـكاشف اللوني للرابط الإنزيمي المخفف ( (Substrate Diluant.9)عبوة محلول الشطف المركز (Consantraed Rinse Solution).
10)عبوة محلول تفكيك الحامض النووي (Denaturation Solution).
11)عبوة محلول التهجين (Hyperdization Solution).
12)ورقة العمل (Woorking Sheets ) .
13)بطاقة قرائة النتائج المحتوية على العلامات الإيجابية للأنواع الوراثية المختلفة للفيروسReading Card)) .
14)جدول تحليل النتائج يحتوي على مخطط لتعريف الأنواع الوراثيه المختلفة من الفيروس الكبدي "سي" (Interpretation Chart)
ملاحظات قبل اجراء الاختبار:
•أخذ الاحتياطات اللازمة لعدم التلوث ومراعاة عدم التنقل بين مناطق العمل المختلفة للحصول على نتائج دقيقة.
•يجب ان تكون جميع محتويات الكاشف في درجة حرارة الغرفة (20ºم - 25º م) قبل بدء العمل بنصف ساعة وعند انتهاء العمل يجب اعادتها فورا الى الثلاجة.
•استخدام حمام مائي هزاز بغطاء مائل مزود بتيرمومتر معاير ودقيق والمحافظة عليه مغلق الغطاء للمحافظة على ثبات درجة الحرارة المطلوبة لإتمام التفاعل وهي (5ºم ± 55º م) وذلك لما لدرجة الحرارة من أهمية في إتمام عملية التهجين و دقة النتائج.
•ضبط مستوى الماء في الحمام المائي لتكون بين ثلث الى نصف ارتفاع منصة القنوات منعا" لتلوث خانات الاشرطة بماء الحمام المائي واستخدام مسكات داخلية لتثبيت الطبق داخل الحمام المائي منعا" لانزلاقة.
•يجب ضبط سرعة الحمام المائي الهزاز وجهاز رج منصة قنوات الإختبار بعناية لضمان مضاعفة حركة الكواشف على الأشرطة بدون تدفق المحاليل واختلاطها بين قنوات الاشرطة.
•استخدام الملقاط في تناول الشرائح النيتروسيلولوزيه وعدم ملامستها باليد حتى لاتفسد عملية التهجين واظهار الالوان بواسطة كريمات اليدين.
•استخدام قلم الرصاص في كتابة الارقام اعلى الشرائط لأن كواشف فحص المعايرة قد تزيل الحبر من الاشرطة.
•المحافظة على الأشرطة في مكانها المخصص داخل منصة القنوات والحرص على عدم جفاف الأشرطة اثناء اجراء الاختبار.
•استخدام الماصات البلاستيكية المعقمة ذات الإستخدام الواحد عند التخلص من المحاليل داخل قنوات المنصة.
الخطوات الاساسية للاختبار:
1-Denaturation ) (فك الزوج الحلزوني المترابط للحمض النووي الفيروسي المكبر(Amplicon ) باستخدام مادة قلوية تغير من طبيعة الاحماض النووية.
2- ( Hyperdization )عملية التهجين السابقة الذكر.
3-( Washing the Strips ) غسل الشريط عدة مرات لازالة المركبات الغير مرتبطة بالشريط وذلك لزيادة كفاءة التطابق بين مكونات الشريط وجين الفيروس المضاف.
4-( Dtection ) الكشف عن حدوث تطابق بين (Oligonuclutide)المهجن للفيروس في العينة المختبرة والتتابعات الموجودة في الشريط باستخدام انزبم .(Alkalin Phosphatase) المرتبط بـ ( Streptoavidine )حيث يظهرالتطابق على شكل راسب بنفسجي تسهل رؤيتة بالعين المجردة .
التحضيرات :
•تحضير محلول الشطف (solution Diluted Rinse)
1.نسبة التخفيف من 5:1 ماء مقطر
2.تحتاج كل عينة الى 8 مل من محلول الشطف ويحضر بإضافة 8 مل من الماء المقطر الى 2مل من محلول الشطف المركز (Consantraed Rinse Solution).
3.يحافظ المحلول بعد تخفيفة على جميع خواصة لمدة أسبوعين اذا حفظ في درجة حرارة من (2˚- 28˚م).
•تحضيرمحلول المتلازم الإنزيمي Diluted Conjugate Solution))
1.نسبة التخفيف من 100:1 من محلول ((Conjugate Diluant
2.يحضر 2مل من محلول المتلازم الإنزيمي لكل عينة بحيث يضاف 20µ من المتلازم الإنزيمي المركز(( Consantraed Conjugate الى1980µ من محلول المتلازم الإنزيمي المخففDiluant) (Conjugate = 2مل.
3.يحافظ المحلول على خواصه بعد التخفيف لمدة 24 ساعة اذا حفظ في مكان مظلم في درجة حرارة الغرفة (20ºم - 25 ºم ) .
•تحضيرالكاشف اللوني للمتلازم الإنزيمي (Diluted Substrate Solution)
1.نسبة التخفيف من 100:1 من محلول الـكاشف اللوني للرابط الإنزيمي (Substrate Diluant).
2.يحضر 2مل من محلول الـكاشف اللوني للرابط الإنزيمي لكل عينه بحيث يضاف 20µ من الـكاشف اللوني للرابط الإنزيمي المركز (Consantraed Substrate) الى 1980µ من سائل الـكاشف اللوني للرابط الإنزيمي المخفف ( (Substrate Diluant.
3.يحافظ المحلول على خواصه بعد التخفيف لمدة 24 ساعة اذا حفظ في مكان مظلم في درجة حرارة الغرفة (20ºم - 25 ºم ) .
خطوات العمل :
1.يوضع محلول الغسيل (Stringent Washing Solution) و محلول التهجين Hyperdization Solution)) في حمام مائي عند درجة حرارة من (37ºم-50ºم ) لإذابة كريستالات المحلول وتجانسها ثم ترج المحاليل جيدا قبل الاستخدام.
2.تسجيل الكونترول السالب ثم أرقام العينات حسب الترتيب على ورقة العمل الخاصه بلإختبار .
3.ترقم قنوات الشرائط بأرقام العينات المراد فحصها مع اضافة قناه للكونترول السلبي.
4.يوض
0µ من محلول Denauration)) في الجزء العلوي من القناة المخصصة للعينة. 5.يضاف باستخدام الماصة الى كل قناة 10µ من الحمض النووي المكبر للفيروس لكل عينه ((Amplicon الى محلول ((Denauration الموجود في أعلى القناه, ثم يتم خلطهم جيدا بواسطة الماصة أما قناة الكونترول السلبي فيوضع به ماء مقطر و تترك العينات في درجة حرارة الغرفه لمدة 5 دقائق.
6.يضاف 2 مل من محلول (Hyperdization) باستخدام الماصة القاذفه الى كل قناة من قنوات المنصه.
7.باستخدام الملقط المعقم توضع الشرائط المرقمة بأرقام العينات (بالقلم الرصاص) الى داخل القنوات المخصصة (الشريط والقناة مرقمين برقم العينة) مع مراعاة أن تكون واجهة الشريط للأمام وغير مقلوب.
8.تغطي منصة القنوات بغطاء بلاستيكي شفاف وتوضع بحرص داخل الحمام المائي الهزاز ((Vortex على سرعة 80 rpm وعند درجة حرارة 50˚م لمدة 60 دقيقة.
9.تنقل منصة القنوات من الحمام المائي الى الخارج وبحذر شديد يتم نزع الشريط اللاصق ثم التخلص من المحاليل بداخل القنوات باستخدام الماصات البلاستيكية المعقمة ذات الإستخدام الواحد.
10.يوضع 2 مل من محلول Solution) (Stringent Wash في جميع القنوات المخصصة في المنصه مع الهز اليدوي الخفيف لمدة تتراوح بين (10 -20 ) ثانية في درجة حرارة الغرفة (20ºم - 25 ºم ) .
11.بحذر شديد يتم التخلص من محلول Solution) (Stringent Washبداخل القنوات وذلك باستخدام الماصات البلاستيكية المعقمة ذات الإستخدام الواحد.
12.تكرر الخطوة 10 ثم الخطوة 11.
13.يضاف 2مل من محلول Solution) (Stringent Wash الى القنوات المخصصة في المنصه ثم تغطي المنصه بالغطاء البلاستيكي الشفاف وتوضع المنصه في الحمام المائي الهزازعلى سرعة 80 rpm وعند درجة حرارة 50˚م لمدة 30 دقيقة.
14.بحذر شديد يتم التخلص من محلول Solution Stringent Washبداخل القنوات باستخدام الماصات البلاستيكية المعقمة ذات الإستخدام الواحد.
15.يضاف محلول الشطف (solution Rinse) المحضر مسبقا لكل قناة من قنوات المنصه مع الهز الخفيف لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
16.يتم التخلص من محلول الشطف (solution Rinse ) بداخل القنوات باستخدام الماصات البلاستيكية المعقمة ذات الإستخدام الواحد.
17.تكرر الخطوة 15 والخطوة 16.
18.يضاف 2مل من محلول المتلازم الإنزيمي Conjugate Solution)) المحضر مسبقا الى القنوات ثم تغطي المنصه بالغطاء البلاستيكي الشفاف وتوضع المنصه على الهزاز ((Orbital shaker على سرعة 160rpm لمدة 30 دقيقة – ثم يتم البدء بتحضير الكاشف اللوني للمتلازم الإنزيمي((Substrate Solution.
19.يتم التخلص من محلول المتلازم الإنزيمي Conjugate Solution)) بداخل القنوات باستخدام الماصات البلاستيكية المعقمة ذات الإستخدام الواحد.
20.يضاف 2مل من محلول الشطف (solution Rinse) المخفف والمحضر مسبقا لكل قناة من قنوات الطبق مع الهز الخفيف لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
21.يتم التخلص من محلول الشطف (solution Rinse) بداخل القنوات باستخدام الماصات البلاستيكية المعقمة ذات الإستخدام الواحد.
22.تكرر الخطوة 20 والخطوة 21.
23.يضاف 2مل من سائل الكاشف اللوني للمتلازم الإنزيمي ((Substrate Diluant الى كل قنوات المنصه مع الهز الخفيف لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
24.يتم التخلص من سائل الكاشف اللوني للمتلازم الإنزيمي ((Substrate Diluant بداخل القنوات باستخدام الماصات البلاستيكية المعقمة ذات الإستخدام الواحد.
25.يضاف 2مل من محلول الكاشف اللوني للمتلازم الإنزيمي (Diluted Substrate Solution) المخفف والمحضر مسبقا الى جميع قنوات المنصه مع ثم تغطي المنصه بالغطاء البلاستيكي الشفاف وتوضع المنصه على الهزاز ((Orbital shaker في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
26.يتم التخلص من محلول الكاشف اللوني للمتلازم الإنزيمي (Diluted Substrate Solution) بداخل القنوات باستخدام الماصات البلاستيكية المعقمة ذات الإستخدام الواحد.
27.يضاف 2مل من الماء المقطر لجميع قنوات المنصه وتوضع المنصه على الهزاز Orbital shaker لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة (20 ºم - 25 ºم ) .
28.يتم التخلص من الماء المقطر بداخل القنوات باستخدام الماصات البلاستيكية المعقمة ذات الإستخدام الواحد.
29.تكرر الخطوة 27 والخطوة 28 .
30.يتم التقاط الأشرطة من القنوات باستخدام الملقط الخاص ثم توضع الأشرطة على ورق الترشيح لتجفيفها في مكان مظلم ثم تتم قرأة النتائج باستخدام بطاقة قرائة النتائج Reading Card .
31 ثم تحلل النتائج باستخدام الجدول Chart Interpretation وذلك لتحديد الأنواع الوراثيه المختلفة من الفيروس الكبدي "سي" في العينات المختبره.
